一、研究背景
木霉菌是作为生物防治菌剂开发的最早的真菌资源,早在20世纪30年代,木霉菌就作为生物杀菌剂在世界各地使用。其中哈茨木霉菌、绿色木霉菌、棘孢木霉菌、深绿木霉菌等应用最为普遍。截至2014年,全球木霉菌植保商品有272个,其中杀菌剂104个,生物刺激剂177个。木霉菌成为世界三大植物病害生防微生物之一,能够防治植物土传病害,修复连作障碍土壤生防微生物。截至目前,我国已登记的木霉菌有18个。
芽孢杆菌是应用最为普遍的生防细菌,20世纪40年代,枯草芽孢杆菌就用于植物病害生物防治。枯草芽孢杆菌、解淀芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌应用最为普遍。芽孢杆菌不仅能够防治土传病害,在防治气传病害时也发挥了重要作用。截至目前,我国已登记的芽孢杆菌有139个。
这两类生防菌具有共同的生防机制,但也有差异性。在生态适应性方面,木霉菌最适合在根际土壤内定殖,仅在特定条件下产生抗逆性厚垣孢子;芽孢杆菌最适合在植物体内定殖,能够普遍产生抗逆性芽孢。在作用机制方面,木霉菌竞争能力、重寄生能力、诱导抗性、解毒作用强;芽孢杆菌的抗生作用强。在抗生素谱方面,这两类微生物可以产生不同种类的抗生素。
如何实现木霉菌和芽孢杆菌的优势互补?途径有二:一是木霉菌剂和芽孢杆菌剂在同一时空或不同时空简单组合使用;二是两者互作产生特异性拮抗或促生代谢物——合成新生物农药。
微生物在共发酵过程中发生多水平互作,不同菌株组合共发酵,可以合成为单一菌剂或简单组合成不同的拮抗或促生物质。这种办法可以减少目前生物菌剂性质的趋同性,创制新型生物农药和生物肥料。
二、微生物共培养技术
微生物共培养技术是让微生物中群体感应信号转移,基于生防真菌和生防细菌同一时空发生多水平互作的诱导效应。微生物菌群与合成代谢物组合,微生物间互作产生特异性物质,微生物间可以实现功能互补与再创造。生防真菌与生防细菌亲和性互作是最基本的条件,微生物共培养技术发现到新/特异性活性物质才有意义。生防真菌—生防细菌共培养产物可以形成拮抗优势,比如棘孢木霉菌+解淀芽孢杆菌共培养代谢物对灰霉菌的拮抗作用,以及木霉菌—固氮菌共培养菌群对豆科作物产品质量的影响。
三、木霉菌和芽孢杆菌共培养技术
木霉菌和芽孢杆菌共培养技术存在三个问题:芽孢杆菌代谢产物对木霉菌的抑制作用;芽孢杆菌代谢产物对木霉菌产孢的抑制作用;双方代谢产物有无互补性。该怎么解决这些问题呢?第一,亲和力筛选是基础,可以通过木霉菌—芽孢杆菌的共培养优势来检测;第二,观察木霉菌和芽孢杆菌在代谢物上的差异,可以通过木霉菌—芽孢杆菌同时接种共培养模式来观察。
试验发现,如果同时接种棘孢木霉菌、解淀芽孢杆菌,可以生成新代谢物。木霉菌与解淀芽孢杆菌共培养可以大量诱导木霉菌产生拮抗和促生物质、免疫性物质、生长调控物等。共培养中的芽孢菌产生特异代谢物宽缨酮,具有医药价值,可以提升体力与活力、减轻疲劳、杀菌、抗溃疡、解热,亦有改善各种病症,如高血压、糖尿病等的功效。木霉菌与解淀芽孢杆菌共培养还可以大量诱导产生氨基酸,共产生76种代谢物,涉及78个代谢途径,其中,15个代谢途径变化最明显,9个与氨基酸代谢有关。
试验表明:(1)与芽孢杆菌共培养,木霉菌共有2,423个基因发生显著变化,说明芽孢杆菌对木霉菌的影响比较显著。(2)与芽孢杆菌共培养,木霉菌氨基酸(19个)和脂肪酸(6个)均显著上调;糖类40%上调(2个)。(3)与木霉菌共培养后,芽孢杆菌中仅有154个基因发生显著变化,说明木霉菌对芽孢杆菌的影响比较有限。(4)与木霉菌共培养后,芽孢杆菌中的脂肪酸(4个)和糖类(1个)显著上调;氨基酸有67%上调(8个),有机酸80%上调(4个)。木霉菌和芽孢杆菌共培养菌群技术可挖掘菌剂新功能因子。
试验发现,不同接种模式芽孢杆菌对木霉菌功能基因表达有不同影响:(1)同时接种技术:芽孢杆菌对木霉菌生长影响大,影响其代谢相关基因表达。(2)顺序接种技术:减少芽孢杆菌对木霉菌生长的抑制作用,有利于诱导木霉菌代谢相关基因的表达。(3)同时接种模式:有利于芽孢杆菌产生特异代谢物,但不利于木霉菌产孢和部分特异代谢物产生。可通过响应面设计解决同时接种模式的不足。(4)顺序接种模式:可在一定程度上解除芽孢杆菌对木霉菌产孢和特异代谢物产生的抑制作用,但在诱导芽孢杆菌产生特异代谢物方面,不如同时接种模式理想。(5)开发以新代谢物为主的生物农药采用同时接种法;开发以微生物产孢和代谢物相平衡的生物农药采用顺序接种法。
四、基于共培养的菌剂的创制与应用
可以利用木霉菌—芽孢杆菌共培养物创制新型生物种衣剂,例如:棘孢木霉菌和解淀芽孢杆菌共培养代谢物对镰孢菌具有抑制作用;共培养菌物与代谢物产物对小麦具有促生作用。木霉菌—芽孢杆菌共培养是创制新型生物农药和生物肥料的重要途径,可进一步拓展生防菌剂的生物防治潜力,提升菌剂生态适应性和多功能性。
五、展望
木霉菌和芽孢杆菌共培养技术是创造新型药物的一个途径,可以进一步拓展,以后的目的不仅是和芽孢杆菌进行共培养,还可以研究木霉菌和其它微生物真菌,如固氮菌或者虫生真菌共培养的技术。共培养的技术很复杂,如何评价是个难题,这方面的工作正在展开。