微 胶 囊

微胶囊化技术,是用高分子化合物等在微生物或化学物质的外部生成一层连续薄膜，形成具有核壳结构小粒子的方法，具有抵抗外界逆境和缓释的作用。微胶囊化技术包含物理法、化学法、物理化学法等。这种内部包裹芯材、微米/纳米尺度的球形粒子，直径大约只有头发丝直径的1/10甚至1/1000，称为微胶囊。

微胶囊能够改变内包芯材的形态、密度、体积、状态和表面性能，保护内包芯材免受环境影响，隔离其活性成分以降低挥发性和接触毒性，做到缓慢可控释放。该技术已广泛应用于香精香料、日化洗涤、美妆防晒、食品工业、相变材料(也称调温材料)、农药肥料、生物医药、油墨涂料等众多领域。利用微胶囊化技术可以保护微生物免受外界环境的胁迫，对于延长活体生物农药和生物肥料的货架期具有重要意义。由于包衣的是活体微生物，因此对成囊材料有较高的要求。

微胶囊制备方法

复凝聚法：该方法是利用两种带有相反电荷的高分子材料以离子间的作用相互交联，制成的复合型壁材的微胶囊。一种带正电荷的胶体溶液与另一种带负电荷的胶体溶液相混，由于异种电荷之间的相互作用形成聚电解质复合物而发生分离，沉积在囊芯周围而得到微胶囊。

单凝聚法：该方法通常被称为沉淀法，通过向含有芯材的某种聚合物溶液中加入沉淀剂，使该聚合物的溶解性降低，该聚合物和芯材一起从溶液中析出，从而制取微胶囊。该方法不需要事先制备乳液，也可以不使用有机交联剂，可以避免有机溶剂的使用，但通过该法制得的微胶囊粒径较大。

界面聚合法：该方法是将两种发生聚合反应的单体分别溶于水和有机溶剂中，其中芯材溶解于分散相溶剂中，然后将两种液体加入乳化剂以形成乳液，两种反应单体分别从两相内部向液滴界面移动，并在相界面上发生反应生成聚合物将芯材包裹形成微胶囊的方法。

该法的优点是反应物从液相进入聚合反应区比从固相进入更容易，所以通过该法制备的微胶囊适于包裹液体，制得的微胶囊致密性好。在界面聚合法制备微胶囊时，分散状态在很大程度上决定着微胶囊的性能。分散状态取决于搅拌速度、溶液黏度以及乳化剂和稳定剂的种类及其用量。

原位聚合法：该方法应用的前提是形成壁材的聚合物单体可溶，而聚合物不溶该法需先将聚合物单体溶解在含有乳化剂的水溶液中，然后加入不溶于水的内芯材料,经过剧烈搅拌使单体较好地分散在溶液中，单体在芯材液滴表面定向排列，经过加热单体交联从而形成微胶囊。如何让单体在芯材表面形成聚合物，是该方法需要控制的重点。

锐孔-凝固浴法：该方法用的壁材是可溶性的。通常将芯材物质和高聚物壁材溶解在同一溶液中，然后借助于滴管或注射器等微孔装置，将此溶液滴加到固化剂中，高聚物在固化剂中迅速固化从而形成微胶囊。因为高聚物的固化是瞬间完成的，所以将含有芯材的聚合物溶液加人固化剂中之前应预先成型，需要借助于注射器等微孔装置。锐孔-凝固浴法的固化过程可能是化学变化或物理变化。

喷雾干燥法：该方法是将芯材分散在壁材的乳液中，再通过喷雾装置将乳液以细徽液滴的形式喷入高温干燥介质中，依靠细小的雾滴与干燥介质之间的热量交换，将溶液快速蒸发使囊膜快速固化制取微胶囊的方法。喷雾干燥法操作备品，综合成本较低，易于实现大规模生产。但该方法制备微胶囊时，芯材会处于高温气流中，有些活性物质容易失活，限制了其应用范围。此外，通过该方法制备微胶囊溶剂蒸发较快，微胶囊的囊壁容易出现裂缝，致密性有待提高。由于高温对微胶囊化微生物仍有损伤，还是需要发展低温喷雾干燥技术。

分子包埋法：该方法采用的芯材必须含有疏水端，用环糊精为壁材，因为环糊精是有疏水性空腔的环状分子。含有疏水端的芯材可以进入空腔内，靠分子间的作用力结合成分子微胶囊。

微通道乳化法：该方法利用表面张力形成微小液滴，微通道的尺寸决定了液滴的尺寸，可以选择适当孔径的膜制备出所需粒径的微胶囊。

超临界流体快速膨胀法：难挥发物质在超临界流体中有很大的溶解度，所以如果将溶质溶解在超临界流体中，然后通过小孔毛细管等减压，可在很短的时间内快速膨胀，使溶质产生很大的过饱和度，形成大量细小微粒超临界流体。快速膨胀法就是将某种溶质溶解在超临界流体中，然后通过减压膨胀，使溶质以小颗粒的形式析出。通过控制实验条件，可以析出具有一定粒径的空心微囊，然后将生成的空心微囊与芯材高频碰撞接触，微囊即可均匀包裹于芯材外部，再除去未包埋的芯材，即可制得微胶囊产品。

酵母微胶囊法：用酵母菌的细胞壁作为微胶囊壁材。实施时需先将酵母菌用酶溶解掉细胞内部的可溶成分，这使酵母菌的细胞壁内部成为空腔，即可以作为微胶囊壁材让芯材与酵母菌细胞壁空腔高频接触，芯材即可进入细胞壁内形成微胶囊，再除去多余的芯材即可。

层-层自组装法：该方法是一种逐层交替沉积方法，即借助各层分子间的弱相互作用(如静电引力、氢键、配位键等)，使层与层自发地缔合形成结构完整、性能稳定且具有某种特定功能的分子聚集体或超分子结构。

微胶囊常用壁材

海藻酸钠：该化合物分子式为(C6H7O6Na)n，是白色或淡黄色不定型粉末状的天然多糖，无味、易溶于水、吸湿性强、持水性能好、不溶于酒精、氯仿等有机溶剂，具有生物黏附性、生物相容性和生物降解性等特点。其黏度因聚合度浓度和温度的不同而不同。海藻酸钠具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、黏附性和安全性，适用于制备药物制剂。

壳聚糖：壳聚糖又称几丁聚糖，是甲壳素经浓碱加热处理脱去N-乙酰基的产物,一种碱性多糖，易溶于盐酸和大多数有机酸，不溶于水和碱溶液。壳聚糖具有良好的生物黏附性、生物相容性、生物降解性以及较好的成膜性，可作为可生物降解材料用于新型给药系统。壳聚糖通过改变给药途径可大大提高药物疗效，具有控制释放、增加靶向性和药物稳定性的特点。另外，壳聚糖本身也具有诱导植物抗性的功能。

明胶：明胶是一种蛋白混合物，不溶于冷水，冷却至40℃以下成为凝胶状，外观为无色或淡黄色薄片或微粒。可溶于热水、甘油、丙二醇、乙酸、水杨酸、苯二甲酸、尿素、硫脲、硫氰酸盐和溴化钾，可吸收本身质量5~10倍的水分而膨胀;不溶于乙醇、仿、乙醚等。明胶能与甲醛等醛类发生交联反应，形成缓释层。明胶具有生物相溶性、生物降解性以及凝胶形成性，适宜于做微胶囊壁材。

以木霉菌为例，不同壁材对木霉孢子保护效果不同，例如对孢子活性保护效果排序:糊精>海藻糖>可溶性淀粉>蔗糖>轻质碳酸钙。

农用活体微生物类产品储存现状--以木霉菌产品为例

影响货架期的因素与贮藏条件：

木霉菌剂货架期是木霉产品质量的重要指标。多数木霉产品需要在低温下贮藏，而在常温下贮藏其活孢子数量经常有较大的损失，其中分生孢子损失最为明显，直接影响了产品的应用效果。木霉菌剂含水量、厚垣孢子比例、保护剂的有效性等是影响货架期的主要因子。

孢子类型与货架期：

货架期是指菌剂产品在推荐的条件下贮藏，能够保持其孢子活性或代谢物含量和性质，保留标签声明的活孢子数、代谢物含量和性质的一段时间。一般在25℃和4℃两种贮藏条件下评价菌剂产品货架期水平。

木霉产生分生孢子和厚垣孢子两种孢子类型，分生孢子主要由固体发酵工艺获取，厚垣孢子主要由液体发酵工艺获取。其中分生孢子对异常的高温等逆境很敏感，易失活，从而影响货架期。随着贮存时间的延长，分生孢子萌发率均呈现明显降低的趋势。厚垣孢子是木霉菌丝在胁迫下形成的一种抗逆性孢子类型，对各种逆境因子均有明显的耐受性，含有较高含量厚垣孢子的木霉产品一般比含分生孢子为主的木霉产品货架期长。

但仅依靠提高厚垣孢子含量还不能完全解决环境胁迫对木霉产品货架期的不良影响。国内外很多厂家建议木霉产品需在7~10℃冷库中保存，至少要在阴凉、干燥处条件下保存。即便在低温贮藏的木霉产品也要在使用前检测产品中孢子活性。

简易检测方法:

将菌剂放入干净的器皿内，加入少量冷开水，混匀，潮湿即可，盖上打孔的塑料膜，在 25~28℃条件下培养3~4d，如果绿色孢子在菌剂表面形成80%以上则为有生防活性的产品。在实验室内检测，一般孢子数不低于千万级(1X107cfu/g)的菌剂对应用效果影响不大。

影响孢子活性的因素与贮藏条件：

(一)木霉抗逆因子木霉孢子对干燥的耐受力与海藻糖含量有关，木霉细胞表面的疏水蛋白、热激蛋白在孢子的抗脱水方面发挥作用。温度的波动会使蛋白质变性，从而改变细胞膜的流动性。木游孢子水分残留量(residual moisture content，RMC)高对孢子存活不利。干燥温度是影响木霉孢子活性的主要外在因素。脱水过程能够使原先受到水分子保护的表面或空间暴露于活性氧的攻击之下，导致氧化胁迫的发生。对活性氧敏感的木霉细胞膜脂、膜蛋自和核酸等极易被氧化，而使孢子失活，因此，孢子的存活率与储存过程中的氧化损伤呈负相关，筛选抗氧化相关基因表达能力强的菌株对木霉产品的实际应用非常重要。

(二)环境因素①温度：温度对木霉产品孢子活性的影响主要来自两个环节。其一，在木霉制备过程中的干燥温度会对孢子活性有较大影响，要尽量采用低温或常温干燥；其二，木霉产品的贮藏温度对孢子活性有影响，产品要尽量贮藏在低温条件下。例如:很多木霉产品在低于0℃条件下贮藏1年孢子仍能存活;产品在5℃条件下贮藏，孢子可存活9个月;产品在24℃条件下贮藏，孢子可存活6个月。产品在4℃冰箱贮存效果最好，室温(25℃以上)贮存效果差。一般在室温下保存3个月后孢子存活率开始大幅度下降。

②水分：木霉产品含水量对孢活性影响较为明显。5%~10%的制剂含水量对分生孢子的存活有利，存活率在70%以上;而含水量大于17%的制剂中，分生孢子的存活率在50%以下。控制产品含水量至5%~8%，可延长货架期。产品含水量低于2.5%时分生孢子的存活率仅为30%左右。因此，木霉产品的含水量并不是越低越好。

③综合因素：影响木霉产品孢子的活性往往是综合因素作用的结果，酸度、温度、含水量、保护剂和载体种类等往往交互影响孢子的活性。一般情况下，首先是温度对木霉孢子活性的影响最大，其次是选用保护剂种类，再次是产品含水量，载体对其影响相对较小。例如:保护里氏本霉孢子活性因素的最佳组合为温度为5℃、含水量为7%、保护剂为糊精、载体为腐殖酸。厚垣孢子浓缩浆pH调到3.0，加入5%淀粉或发酵72h浓缩浆调pH到3.0，加入5%淀粉均有利于延长货架期。

延长货架期技术：

延长木霉菌剂货架期技术是提高产品质量的关键技术之一。液体发酵过程中尽可能多的诱导厚垣孢子产生，或在发酵后的菌物中加入孢子保护剂，微胶囊化技术是非常有优势的解决方案。

①诱导厚垣孢子形成技术厚垣孢子由菌丝发育面来，体积大、内含物多、细胞壁厚，萌发快;分生孢子从产孢器官产生，分生孢子小、细胞壁薄。厚垣孢子一般在液体发酵后期产生，逆境条件下更容易被诱导产生。厚垣孢子抗紫外线能力强，可在40℃下萌发，而分生孢子抗紫外线能力弱，在40℃下不能萌发。室温和低温条件下厚垣孢子比分生孢子更耐贮存，厚垣孢子对尿素耐受性明显比分生孢子高。培养基中玉米粉和大豆粉、燕麦粉、蛋白胨、牛肉膏、腐殖酸有利于诱导木霉产生厚垣孢子。芽孢杆菌上清液、微量抗生素(枯草芽孢素)、硫酸铵、植物油、酪蛋白、苯并噻二唑(BTH)、微量元素等在一定浓度下均能促进木霉厚垣孢子产生。减少培养基中钙离子(≤0.1mmol/L)、浓缩浆中加人CuSO4(20mg/L)均有利于厚垣孢子形成。发酵60~90h交替光暗处理，也有利于厚垣孢子产生。木霉-芽孢杆菌共培养、诱导木霉vell和lae1等基因表达均有利于产生厚垣孢子。

②木霉微胶囊化技术研究表明，木霉经过3%海藻酸钠和1.5%氯化钙一次微胶化包衣后，再用壳聚糖进行二次微胶囊化保护，其产品在常温下(28℃)货架期可达到1~2年，并提高了菌剂抗紫外线、缓释和全水溶性的效果。该技术的优势是在常温(28℃)下成囊。利用麦芽糖糊精和阿拉伯树胶复合生物多聚物基质微胶囊化木霉分生孢子，然后通过喷雾干燥制备成微胶囊化分生孢子产品，产品中的孢子活性得到很好保护，微胶囊化的分生孢子产品比未经微胶囊化的分生孢子产品对喷雾干温度耐受性提高了11倍，这也是常用微胶囊化材料。2%蔗糖、黑糖蜜和甘油、10%纤维素和海藻酸钠均可提高木霉分生孢子的存活率，分生孢子产品均能在出风温度60℃下进行喷雾干燥。

其他孢子保护技术：

在滑石粉、液状石蜡-甘油、甘油制剂中，孢子的存活率下降相对较慢;6个月后孢子存活率最高的是菜籽油-甘油制剂，不同载体对孢子活性也有明显的影响，从保护效果排序:硅藻土>腐殖酸>海泡石>滑石粉>膨润土。

在发酵过程中或在发酵制备的浓菌浆或菌粉中加入各种保护剂也可延长产品货架期。在培养基中加入3%和6%的甘油，可使木霉分生孢子产品货架期延长至7~12个月，而对照产品货架期仅有4~5个月。在培养基中加入壳寡糖，可使分生孢子产品货架期延长1~2个月，加入海藻酸盐和液状石蜡也能延长木霉产品的货架期。在液体发酵得到的棘孢木霉菌物糊中加人3%淀粉和少量铜、降低pH等操作均能延长产品在常温下的货架期，至少可达半年。1%十二烷基硫酸钠(SDS)防护紫外线的作用最强，加人SDS后木霉分生孢子的死亡率仅为5.53%，其次分别为0.1%黄腐酸钠、0.1%黄原胶、0.1%和0.5%糊精，分生孢子的死亡率分别为9%~15%。而0.2%甲基纤维素的防护效果较差。